牡丹芍药远缘杂交亲和性

芍药科芍药属的牡丹与芍药，被誉为 “花中二杰”，是我国的传统名花，花型多变，花色艳丽，具有较高的观赏价值和生产价值，在国内外花卉市场中占有重要地位。牡丹、芍药的杂交育种始于１９ 世纪的法国，至今已有１００ 多年的历史，通过杂交育种已选育出一系列具有较高观赏价值、抗寒、抗病等特点的新品种，例如，著名的ｉｔｏｈ 杂种，ｉｔｏｈ杂种外形美观，新奇芳香能满足人们“色香兼备”的需求，是目前牡丹、芍药中最受欢迎的类群，许多品种现已在世界范围内广泛流通，虽然价格昂贵，但仍然供不应求 。

远缘杂交是重要的变异来源，许多优良品种均来源于此。远缘杂交是将有利性状转入目标材料从而获得新物种的有效途径，然而远缘杂交往往存在严重的不亲和现象。利用荧光显微技术对植物远缘杂交花粉与雌蕊亲和性的研究已在菊属、百合、紫薇 、杜鹃等植物中报道。

２００８ 年中国首次发现并鉴定了牡丹、芍药远缘天然杂交后代‘和谐’。‘和谐’具有很强的杂种优势和较高的应用价值，‘和谐’的发现弥补了我国牡丹、芍药组间杂交的空白。在牡丹、芍药组间杂交育种方面仅见何桂梅 进行了杂种胚培养的尝试研究。律春燕等通过荧光显微观察，研究了黄牡丹（paeonia lutea）与不同芍药品种组间杂交花粉与柱头的亲和性。由于组间花期不遇或远缘杂交不亲和等原因， 牡丹组与芍药组之间杂交难度大，结实率较低。因此，探讨牡丹和芍药杂交不亲和的原因，对提高育种效率，培育综合性状优良的牡丹新品种具有重要意义。由于种间杂交结实率与亲本生殖器官发育密切相关，本研究分别选取生长势较强，瓣性较低，雌蕊发育完全，结实率较高的‘凤丹白’ （paeonia ostii‘ｆｅｎｇｄａｎｂａｉ’）和‘粉玉奴’（paeonia lactiflora‘ｆｅｎｙｕｎｕ’）为父母本，观察亲本花粉粒形态及杂交和母本自然授粉的结实率，并对授粉后柱头花粉萌发和生长过程进行观察，以探究牡丹和芍药远缘杂交不亲和机理。#p#分页标题#e#

1 材料与方法

试验所用母本芍药品种‘粉玉奴’与父本牡丹品种‘凤丹白’均引自山东菏泽，于２０１１ 年栽植于河南农业大学三区苗圃基地，植株生长良好，可以正常开花结实。

去雄和授粉：试验于２０１３ 年４─５ 月份进行，采集‘凤丹白’花药置于室内使其自然散粉，随后收集花粉，将收集好的花粉置于装有变色硅胶的干燥器内，冰箱内４℃保存，定期测定花粉活力。采用离体培养法测定花粉活力，培养液为５０ ｍｇ?ｋｇ－１ 硼酸＋１０％蔗糖，２４ ℃下培养６ ｈ。授粉前亲本花粉活力大于４０％ ，可用于授粉。

于２０１３ 年４ 月下旬至５ 月上旬芍药盛花期，每天下午选取翌日开放花蕾的母本植株进行人工去雄套袋， 第２天０９：３０─１０：３０ 进行当日授粉，并立即套袋、标记挂牌。

芍药开花习性和柱头可授期的确定：选择饱满无病虫害的花朵在紧蕾期进行标记并跟踪观察，观察并记录花器官形态变化。分别取紧蕾期、大蕾期、开花第１、２、３、４、５、６、７、８ 天不同时期花朵的柱头各２０ 个，在显微镜下观察柱头黏液分泌情况，记录黏液分泌最多的时期，确定为最佳授粉期。花粉扫描电镜观察： 将收集的花粉经硅胶干燥后， 固定于样品台。离子溅射仪镀金后，在日立ｓ－３４００ｎ 扫描电镜下观察、拍照。每次选５ 个花粉，重复３ 次、ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ｃｓ 分析和处理图像数据。花粉萌发和花粉管伸长的荧光显微观察：花柱压片参照ｋｈｏ ｅｔ ａｌ．［１７］ 的方法并加以改进。分别于授粉后８、１６、２４、４８、７２、９６ ｈ 取雌蕊放入ｆａａ 固定液中固定２４ ｈ以上，复水（７０％酒精─５０％酒精─ ３０％ 酒精─蒸馏水）；随后在８ ｍｏｌ?ｌ－１ ｎａｏｈ 溶液中常温软化处理１２ ｈ；用蒸馏水漂洗；用０．１４ ｍｏｌ?ｌ－１ｋ２ ｈｐｏ４ 的０．１％水溶性苯胺蓝溶液染色６ ｈ。雌蕊压片，在ｎｉｋｏｎ ｅｃｌｉｐｓｅ ｔｉ 型荧光显微镜下以紫外光为激发光，观察花粉和柱头并拍照。#p#分页标题#e#

2 结果与分析

2．1 芍药开花习性和柱头可授期的确定

‘粉玉奴’为芍药早花品种，整体花期为４ 月２５日─５ 月３ 日，较为集中，４ 月２８ 日进入盛花期；芍药露色期较长，１ 周左右；松雷─大蕾─开放的过程需要１～２ ｄ，个体之间差异明显，部分花朵从松蕾到开放只需１２ ｈ；盛花期４～６ ｄ；盛开的花朵每天１６：３０左右开始出现闭合的趋势，花瓣合拢。花药在开放第１ ｄ 时陆续开裂散粉，但是也有少部分个体在花未完全开放即大蕾期就已经散粉，因此，去雄套袋工作要在松蕾期及时完成。

母本‘粉玉奴’花朵柱头在花开放第２ 天开始分泌黏液，随着时间增加，黏液分泌量逐渐增多，但是第２～３ 天个体差异较大，第５ 天黏液分泌量达到最大，随后逐渐减少，第７ 天柱头部分个体有黏液分泌，第８ 天的柱头没有观察到黏液。

2．2 杂交亲本花粉的扫描电镜观察

远缘杂交亲本花粉粒形态差异直接影响花粉在柱头上的黏附。通过扫描电镜观察到牡丹品种‘凤丹白’与芍药品种‘粉玉奴’花粉粒形态有相似性，由表２ 可知，二者均为中型花粉，花粉粒大小差异不明显。花粉粒形状为长球形，赤道面观为长椭圆形，极面观为三裂圆形，具三拟孔沟，具沟膜。但是在细部特征上略有差异，‘凤丹白’表面纹饰为细网状纹饰，极面平截，网眼多边形少圆形，网眼频率较高，网眼直径大于网脊宽度，而芍药表面纹饰为穴网状纹饰，极面平滑，网眼频率较低，网眼直径小于网脊宽度。母本花粉畸形率远大于父本，‘凤丹白’花粉畸形率较低，适合授粉。

2．3 远缘杂交结实率与芍药自然授粉结实率对比

牡丹与芍药远缘杂交表现出严重的不亲和性，授粉５７９ 朵，结果数３０，获得种子４９ 粒，结果率５．２％。在开花期标记３００ 个芍药花朵，果熟期统计标记花朵的结果数为２２８，芍药的自然结实率为７６％。#p#分页标题#e#

2．4 远缘杂交授粉后花粉管的显微观察

人工授粉后‘凤丹白’花粉能够在芍药柱头上正常萌发，但是达到最大萌发量的时间比离体培养所用的时间长，部分花粉管能够伸入柱头，最远可伸入到花柱１／２ 处，未见花粉管穿过花柱进入子房，完成受精。花粉萌发和花粉管伸长受到了一些阻碍。具体表现为授粉８ ｈ 后观察到有花粉黏附到柱头，少数花粉萌发，花粉管伸长；授粉１６ ｈ 后花粉萌发个数明显增加，花粉管继续伸长，但未伸入柱头，柱头乳突细胞产生胼胝质反应；授粉２４ ｈ 后花粉萌发量达到最高，这与律春燕等［１６］ 的研究一致。但是花粉管存在不同形式的畸形，尖端异常膨大，有的花粉管在柱头表面出现缠绕、扭曲、肿胀、结合、分枝等现象，并有部分花粉管伸长迟缓；授粉４８ ｈ 后，观察到有少量花粉进入柱头，花粉管成束状向花柱延伸，柱头上积累的胼胝质成散点状分布；授粉７２～９６ ｈ，萌发的花粉数逐渐减少，胼胝质积累持续增加。

3 结论与讨论

远缘杂交的成功依赖于植物传粉受精过程中每一个环节，从花粉粒的附着、萌发，花粉管的生长，双受精的完成，到合子、胚乳的发育等，其中任何一个环节发生障碍，都会直接导致杂交的失败 。因此，授粉前亲本花粉育性 、雌蕊发育状况 ，授粉后花粉在柱头萌发及花粉管生长情况 ，对杂交结实率有很大的影响。

本试验通过对母本‘粉玉奴’开花特性和柱头分泌黏液情况的观察，确定开花后第２～６ ｄ 为柱头的可授期，开花后第４～５ ｄ 可授性最强，黏液能够黏住花粉，这与红雨等 的研究结果略有差异，推测可能是由于栽培地气候环境不同所致。结合母本开花的习性，杂交授粉工作应该在母本松蕾期或大蕾期去雄套袋，在套袋４ ｄ 后进行人工授粉。#p#分页标题#e#

本研究结果显示，‘凤丹白’与‘粉玉奴’远缘杂交存在受精前隔离，即杂交不亲和。杂交父母本自身结实率均较高，且授粉前父本花粉生活力较高，而且能够在母本柱头上正常黏附，花粉也可萌发生长，这表明杂交亲本均具有可育性。但是花粉与柱头的相互识别作用，导致一系列的胼胝质反应阻碍花粉管的穿行，使其无法进入花柱，伸入子房完成受精作用。在花粉萌发的荧光观察试验中发现，花粉管与花柱内大量胼胝质积累，花粉管在伸长过程中出现缠绕、扭曲、肿胀、结合、分枝等现象，授粉４８ｈ 后，仅有少量花粉管生长到花柱１／２ 处，未能完成受精。这与律春燕 、王文和 、陈伟峰 等观察到的现象相似。李守丽等对大百合与百合属间杂交授粉后花粉管的行为进行了观察，百合的花粉萌发与花粉管的伸长速度相对于自交滞后，个别花粉管出现末端分叉、膨大或变细或中间部分折叠，花粉管内胼胝质不规则的大量沉积，这些识别反应导致结实率低。因此，受精前障碍是远缘杂交结实率低的重要原因，授粉后花粉管正常生长并穿过柱头是牡丹芍药远缘杂交较高结实率的重要保障。在今后的杂交育种工作中可以尝试采取花粉蒙导、药剂涂抹柱头、花柱短截、试管受精等方法开展牡丹芍药远缘杂交试验。

本试验通过‘凤丹白’与‘粉玉奴’远缘杂交，得到了少量的种子，虽然杂交亲和性与花粉管的行为有关，杂交的成功与否还受到受精后胚胎与胚乳发育的影响。关于受精后障碍、胚胎发育、杂交种子的萌发等方面还要从胚胎学和遗传学方面进一步探讨研究。